HPLC资料汇编（1）

梯度洗脱时应该注意的一些问题

在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此必然带来一些特殊的问题，

我们必须充分的重视。

1、  要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定的

比例内互溶，超出一定的范围后就不会互溶。例如：乙腈和1mol/L的醋酸铵（PH  5.16）

做梯度洗脱，乙腈含量超过70%时就会出现不溶，甲醇和乙烷混合，甲醇含量高于30%

时就会分层等。当有机溶剂和缓冲溶液混合时还可能析出盐的结晶体，尤其使用磷酸盐

时需特别小心。

2、  梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证好的重现性。进行样品分析前必须进行空白

梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头上后会被强的溶剂

洗脱出来，用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止溶剂混合时产生气泡。

3、  混合溶剂的黏度常随组成而变化，因此在梯度洗脱时常会出现压力变化，例如纯水或甲

醇的黏度都比较小，但是当二者以相近的比例混合时黏度会增大很多，此时的柱压是纯

水或甲醇为流动相时的两倍。因此要防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱所能

承受的最大压力。

4、  每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始的状态。需让10~30倍

柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相和初始流动相达到完全平衡！

5、  注意梯度洗脱用水的有机物残留，往往在等度洗脱时用的水，在梯度洗脱时发生问题（鬼

峰），这是因为在梯度过程中，水占的比例很高时的流动相洗脱能力很低，此时水中的有

机物残留就被色谱柱吸附并浓缩，等到强溶剂占高比例时，浓缩的有机物被高洗脱能力