药品检验对分光光度计的要求与评价

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药品检验对分光光度计的要求与评价
孙国新
中国药典（1985年版）二部采用紫外可见分光光度计测定药品的“吸收系数”(E1cm 1%值)的有45项，用于“含量测定”的有398项（其中应用标准E值的占237项，标准品的占161项）；用作“鉴别”（包括测定波峰λmax、波谷λmin或A峰-A峰比值、A峰-A谷 比值等）有337项；用作“检查”药品纯杂程度的“透光率”T值或“吸光度”A值的共43项；测定药物制剂的“溶出度”（或释放度）的有102项；测定“含量均衡度”的有75项。显然紫外分光光度法已成为药品检验的重要分析方法。测定结果的准确程度与仪器的性能指标密切相关。本文根据中国药典并参照新版的日、英等国家药典，提出对仪器性能指标的基本要求和对仪器的选型、验收的综合评价。
1、        波长范围、准确度和重现性
药典中通常使用的波长约在210~600nm。实际试样扫描时波长范围要适当延伸，一般不窄于200~700nm 即可。仪器光源氘灯短波能量低，光电检测器对短波光的灵敏度也低，而溶解试样所用的溶剂对短波光的吸收较大，总的效应是波长愈短，定性定量测试的难度愈大。仪器即使在200nm处能调零（调100%T或0 A），也不一定能在220nm处测定样品的最大吸收A峰值。例如降血压药卡托普利的原始标准有一项鉴别是在205nm处测定λmax的  A峰 值（扫描时延伸到200nm），实测时只有少数几种型号的仪器能完成这项测定，该标准修订时删除了这项鉴别。可见，应用范围往往受到仪器性能的制约。一些中高档仪器的波长范围短波延伸到190nm甚至到185nm，这标志着仪器性能优良，实际使用的选择余地也较宽。
    中国药典对仪器的波长准确度未作具体要求，但规定试样的最大吸收波长允差为±2nm，考虑到样品本身的偏差，一般普及型仪器的波长准确度为±0.5nm即能符合要求（英国药典1993年版规定仪器的波长准确度在200～400nm内允差为±1nm，在400～600nm内为 ±3nm）。在进行计算分光光度法（如双波长法）测试时，测试点往往在吸收曲线的峰肩上，波长误差会造成较大的附加吸光度误差，仪器的波长准确度须达到±0.2nm 或更小，只有中高档仪器才能满足要求。
    波长准确度可方便地应用仪器自身的光源氘灯的特征谱线486.0nm、656.1nm作检定或校正的基准。对于中高档扫描仪器还可以选用低压汞灯、氧化钬滤片、高氯酸钬溶液的波谱在指定的谱宽下作检定校正[1]。
    仪器的波长准确度劣于指标值时应进行校正。具有自校功能的中高档扫描型仪器一般自校1～2次即可符合要求。对于中低档数显式仪器，波长准确度指标△λ≤±0.5nm，如能符合：
    △λ486.0nm-△λ656.1nm≤±0.5nm则可通过简单的“平移”来校正（△λ为实测λ与特征谱线λ的差）。例如用氘灯检定波长的检定值为488.0nm和658.3nm，即波长误差△λ分别为+2.0nm和+2.2nm。校正时可调整波长显示用的齿轮平移-2.0nm，则△λ分别成为0.0nm和+0.2nm。即使平移过了一点，如为-2.4nm，则△λ分别成为-0.4nm和-0.2nm，仍符合指标规定。若不能符合上式，例如△λ为+0.5nm和-0.5nm，似乎它的误差未超过±0.5nm，但按上式计算则为1.0nm，已超过±0.5nm指标。仪器在200～350nm紫外区的误差可能更大，这时应增加紫外区的波长误差检定，若△λ仍然大于±0.5nm，则检定不能通过，也不能通过简单的“平移”来校正，应反复调整单色器内的波长传动机构，直至符合规定。
    波长重现性具波长准确度的基础，它的指标一般比波长准确度指标更窄。
2、        谱宽和分辨率
谱宽一般是指仪器光源（氘灯）的特征光谱以单光束方式通过设定的狭缝后的波峰的半幅值△λ。最小可设定狭缝下的谱宽即“分辨率”。谱宽可利用仪器氘灯的特征光谱656.1nm作检定[2]。结果可在标称值的±20%内，扫描型仪器也可用φ=0.020%甲苯的环乙烷溶液在波峰269 nm和波谷266nm之吸光度比值不得小于1.5作为仪器的分辨率限度指标[3]，或以苯蒸汽在258.9nm和259.5nm间的峰谷值D>8% T作为“分辨深度”的指标[1]。
中国药典规定：“仪器的狭缝波带宽度应小于供试品的吸收带半宽度，否则测得的吸光度会偏低”。这里“波带宽度”和“吸收带半宽度”都是指“谱宽”。实际工作中仪器的谱宽选择为试样吸收带谱宽的1/10为宜。定量分析一般设定谱宽为1～2nm。鉴别时则根据试样的吸收峰宽窄设定谱宽为0.5～2nm。测定物质精细结构（如苯蒸汽峰等）则设定谱宽为0.1～0.2nm。仪器的谱宽不得大于2nm，否则测得的试样溶液的吸光度偏低，已不适用于药品检验。
3、杂散光
中国药典规定：仪器的杂散光在220nm处以质量分数w为1.00%的NaI溶液，在380nm处以w为5.00%的NaNO2溶液检定均小于0.8%T。这是一项顾及大量使用的中低档仪器实际水平的最低限度指标。杂散光对测光准确度影响较大，是一项不容忽视的性能指标。仪器在不同波长处的杂散光是不相同的。在仪器波长范围的边缘处和换灯波段，光源的能量较低，光电检出器的灵敏度差，仪器的信噪比差，杂散光较大。在该处测试时，尤其是当试样的浓度较大时，杂散光对测光准确度的影响较大。如试样的吸光度为1A（即10%T），0.1%T的杂散光使吸光度变为0.9957A或1.044A（即9.9%T或10.1%T），产生了约0.4%的附加误差。若杂散光为0.8%T时则误差增至约3%T这样就远达不到药品检验对准确度的要求。这也是药典中避免在吸光度>0.7A处作定量测试的原因之一。低档和高档仪器的杂散光指标的差距可相差3～5个数量级。高档仪器的杂散光极低，仪器的读数范围可能不够宽，检定时需在参比光束侧加装衰减器后测定[4]。对于紫外光区短波长段光学性能较好的仪器不可以用w为1.2%的KC1溶液在200nm处测定杂散光[3]。光源中，氘灯的杂散光比卤钨灯的小，使用波长在换灯时尽量采用氘灯。
4、        测光准确度和重现性
测光准确度是紫外可见分光光度计最重要的性能指标，生产厂一般用透光率准确度△T（T测-T标≤△T）或吸光度准确度△A（A测-A标≤△A）来表示（均为绝对误差）。
    透光率T%是仪器测光的原始值，吸光度A是它的转换值：A=-lgT。吸光度准确度则为：△A=-lgT测-（-lgT标）=lgT标-lgT（T标±△T）。仪器的透光率准确度△T在0～100%T全范围内是个确定的值，因对数转换的非线性，该值在不同的测光坐标（以透光率或吸光度表示）处相应的吸光度准确度△A是不同的。例如△T为0.3%T，在0.5A测试时相应的△A为±0.004A，在1A处为±0.013A（转换值）。

    紫外可见分光光度计测定药品溶液的定量依据是比耳定律：A=E1cm 1%.b.c，式中E为吸收系数，b为光径长度（1cm），c为样品浓度。仪器检定时采用K2Cr2O7的纯度>99.98%，准确称重稀释，浓度误差极小，c为常数，仪器的检定值△E/E即代表仪器在该测试点的△A/A；当仪器测试样品时，该样品的吸收度系数E为标准值，是一个常数，则样品的测试误差△c/c取决于仪器的测光误差△A/A（这些都是相对误差）[5]
    中、日、英等国家药典即是以60mg/L的K2Cr2O7标准溶液在235nm、257nm、313nm和350nm4个波长处测定E值，与各标准值作比较，均应<±1.0%，即△E/E=（E测-E标）/E标×100%≤±1.0%，△T、△A/A通过比耳定律的转换曲线见图1。
    图中曲线a、b为透光率准确度，△T为0.3%T和0.5%T时在不同测光范围内的△A/A值的转换曲线，c为中国药典要求仪器的检定值△E/E为1.0%的水准线。a和c相交表示，若仪器的透光率准确度△T≤0.3%T，在吸光度为0.2～0.8A时△E/E≤1.0%，能符合中国药典要求。曲线a还表明，仪器吸光度在0.4～0.5A时△E/E值有最小值。测试时选定的A值偏大偏小时△E/E值均变大，尤其是小于0.2A或大于0.8A时急剧变大。要使测试值的相对误差较小，应调整样品溶液的浓度，避免在吸光度过小、过大处测试。这也与药典提出的“一般供试品溶液的吸光度读数，在以0.3～0.7A之间误差较小”相吻合。设计药品质量标准时，总是适度调整药品稀释倍数，使试样的吸光度在0.5A左右；而考察药品标准的适应性时，则先使试样的吸光度在0.8A左右，再稀释一倍为0.4A左右。这也是考虑到仪器测光准确度的线性范围与试样浓度变化范围互相适应。曲线b在c的上方不相交，表示△T为0.5%T时，测光准确度已不能保证符合药典要求了。d、e、f表示，在测光范围内为1A处，测光准确度△A为0.003A、0.004A、0.005A时相应的△A/A值的坐标。g、h表示在0.5A处，测试准确度△A为0.002A、0.005A时相应的△A/A值的坐标，它们均≤1.0%，能符合药典的要求。其中f、h的△A虽均为0.005A，但△A/A值却相差一倍。而e的△A为0.004A（在1A处），g的△A为0.02A（在0.5A）处，它们的△A/A值却是相同的。这些是仪器选型、检定、验收时应注意的。
    测光重现性是测光准确度的基础，同样是重要的。其指标一般为测光准确度指标的一半或更小。中国药典中有相当一部分药品分析是采用对照品与样品同样稀释后作吸光度测试的，它的测定准确度取决于仪器的测光重现性指标。
中国药典检定测光准确度的测试波长均在紫外区，检定用K2Cr2O7标准溶液，这与药品的定量分析法较为接近。生产厂一般用NBS930D标准滤光片检定，6个测试波长均在可见光区，若能两者兼用则较全面。同一台仪器，采用K2Cr2O7溶液检定，准确度指标为±1.0%，采用滤光片检定，准确度指标为±0.3%（或±0.004A，1A处），这种差异不是仪器本身而是不同检定方法所致。
5、        吸收池及池座
在药品分析中，紫外可见分光光度计测定药品溶液的吸光度，吸收池的光径准确度和配对性直接影响仪器的测光准确度。应用最广泛的吸收池光径为10mm。国产吸收池的光径指标为（10±0.03）mm，平行度为±0.002mm。英国药典为（10±0.05）mm。仪器使用者主要测试吸收池的配对性。对于数显式仪器可在235nm、257nm、313nm和350nm波长处测试，对于扫描型仪器可在200～350nm扫描，吸收池反转后再测一次，观察池的平行性，确定较好的取向，作记号使用。
仪器采用拉杆式池座时，应检定其不同定位时的重现性。
6、        仪器的其他性能指标
数显式仪器的读数漂移值、噪声、扫描型仪器的基线平直度、稳定性、线性范围等也是仪器的重要性能指标，应按说明书进行检定。各生产厂规定的测定条件不尽相同（如测试时谱宽较窄则要求较严），应予以注意。
7、        仪器的性价比
分析仪器以商品的形式从生产厂转到使用者手中，人们一般会从经济的视角评价仪器的性能。“性能价格比”作为评价的尺度虽难得到一个精确的数学模式，但作为从定性印象转为定量的模糊概念却是有益的。一般可将待考察的仪器性能指标和某些功能指标顺序列出加权赋值、求和，再除以仪器价格。试以文献[6]表1“紫外可见分光光度计性能指标对照”为例，可选取使用较普遍的某台进口仪器作参考。将波长准确度设为15，测光准确度设为25，分辨率、波长重现性各设为5，其余各项均设为10，总值为100（也可按专业要求设为其它数值）。各仪器的性能指标与之对照，按优劣加减。例如测光准确度对照值±0.3%T、±0.004A（1A）设为25。若为±0.4%则减10～20，若为±0.003A（1A）则加15～25，自行按同一准则定值，求出总值，各除以仪器价格即可。以此作为选型的参考。目前，国产普及型数显式紫外可见分光光度计的性能指标已达到或超过某些进口同类仪器；国产中高档扫描型仪器的性能指标已接近进口同类仪器水平，而价格仅为1/2～1/3，性能价格比较高。在选型时还应注意到仪器的性能指标与实测性能可能名实不符，差距幅度不一，可通过访问仪器用户，实地考察样机性能，了解仪器制造厂的信誉和售后服务的优劣，观察仪器的造型，机械加工的精细程度等等，进行综合评价。